復(fù)制衰老概念的提出

　　1961年,Hayflick及Moorhead證明了體外培養(yǎng)的人類正常成纖維細胞的壽命是有限的。4年后,Hayflick發(fā)現(xiàn),連續(xù)培養(yǎng)的人二倍體細胞株,經(jīng)過一段旺盛繁殖期(一般不超過1 年) 后,即出現(xiàn)形態(tài)變化,停止有絲分裂,直至死亡。Hayflick 將這種正常人體細胞在體外分裂潛能受限制的現(xiàn)象稱為細胞衰老,或者更準確地說,復(fù)制衰老。這種現(xiàn)象提示:復(fù)制衰老可能是生物體生命周期在細胞水平的重演，體外細胞培養(yǎng)中的復(fù)制衰老可以反映體內(nèi)衰老發(fā)生的過程。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)制衰老發(fā)生的基礎(chǔ)是細胞群體倍增次數(shù)，而不是時間。復(fù)制衰老的特征是細胞周期中G1期不可逆停滯，細胞經(jīng)多次分裂后，在腫瘤抑制因子p53和Rb作用下，細胞對生長因子等失去反應(yīng)，產(chǎn)生DNA合成蛋白抑制因子，細胞周期檢查點(checkpoint)發(fā)送細胞周期停止信號，DNA合成停止，細胞不可逆地停滯于G1期，發(fā)生衰老(senescence，M1期)。此時細胞具有一些特征：形態(tài)大而扁平，酸性 半乳糖苷酶和多種細胞周期抑制蛋白上調(diào)。細胞再經(jīng)過20～30群體倍增次數(shù)(population doublings，PDs)后，進入危機期(crisis，M2．期)，細胞出現(xiàn)退化，LundbergAS等的研究表明這些退化包括雙著絲粒形成、染色體變短而失穩(wěn)，分裂細胞逐漸減少，細胞發(fā)生凋亡或死亡[1]。而且許多生理性刺激可以誘導(dǎo)細胞衰老，如持續(xù)傳代、氧化損傷和原癌基因激活等。

　　復(fù)制衰老與端粒

　　Harley于1990年第一個證明了正常細胞衰老時的端粒丟失。他們發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人成纖維細胞端粒平均長度以一種復(fù)制依賴性方式縮短。這種縮短與體內(nèi)衰老相關(guān),老年供體成纖維細胞和外周血細胞中端粒平均長度比年輕人短。這些研究提示端粒是有絲分裂計時鐘的分子基礎(chǔ)和調(diào)節(jié)機制

　　端粒酶是由RNA(hTER)和蛋白質(zhì)亞基(hERT)構(gòu)成的具有逆轉(zhuǎn)錄活性的核糖核酶，其特有結(jié)構(gòu)存在于真核生物染色體末端，其功能主要是以RNA為模板，合成串聯(lián)排列高度保守的六步格重復(fù)序列(TTAGGG)，以維持端粒長度的穩(wěn)定性，它們從核酸外切酶降解和染色體互相融合中交織進穩(wěn)定的線狀同源染色體中。此外，還阻止其它異常形式的染色體重組和附件進入核基質(zhì)，他們決定了人有絲分裂細胞最大復(fù)制能力。因而認為端粒酶與細胞衰老密切相關(guān)。端粒酶活性的存在可以抑制細胞衰老、增加體外培養(yǎng)細胞的倍增次數(shù)，正常體細胞一般不表達端粒酶，而大部分干細胞如皮膚基底層細胞、造血干細胞、生殖細胞、腫瘤細胞表達端粒酶活性[2]。

　　復(fù)制衰老與β2半乳糖苷酶

　　Dimri 等1995 年首次提出了一種可在體內(nèi)鑒別衰老細胞的生物學(xué)標志———β2半乳糖苷酶。他們報道體內(nèi)或體外的衰老成纖維細胞和角質(zhì)細胞均表達此酶,而休眠細胞和終末分化細胞則缺乏,永生化細胞中也無此酶的表達。由此提供了衰老細胞在體內(nèi)衰老過程中存在并積聚的直接證據(jù)。

　　復(fù)制衰老與氧化應(yīng)激

　　端?？s短的隨機性是由于后隨鏈合成時末端引物定位的隨機誤差、端粒的重排和氧化應(yīng)激造成的端粒DNA單鏈損傷引起的，其中引物定位誤差和隨機重排都受到氧化應(yīng)激造成的端粒DNA位點損傷情況的影響，因此氧化應(yīng)激通過損傷端粒DNA而加速端?？s短，從而加快細胞衰老。

　　二.復(fù)制衰老在眼科的研究進展。

　　1．復(fù)制衰老與晶狀體上皮細胞

　　晶狀體上皮細胞與皮膚基底細胞來源于同一胚層，具有相似的性質(zhì)，在一生中處于不斷的增殖狀態(tài)，以形成晶狀體纖維細胞，具有干細胞的特性。

　　研究表明，LEC存在端粒酶活性表達，其活性隨LEC的增殖傳代逐漸減弱直至低于檢測水平。體外培養(yǎng)使LEC脫離了體內(nèi)的微環(huán)境，從而失去“干細胞”的特性，細胞向終末表型分化，喪失端粒酶活性。LEC在經(jīng)過多次傳代后細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞變長，向纖維細胞轉(zhuǎn)化，纖維細胞是LEC分化后的功能細胞。干細胞在體外培養(yǎng)過程中較難保持原有特性的現(xiàn)象在其他細胞系中也可以見到。Matsui[3] 在體外皮膚基底層上皮細胞也觀察到類似的現(xiàn)象

　　David[4]等報道在人、牛、兔晶體的實驗中，僅有在6個月兔晶體中央上皮組織表現(xiàn)端粒酶活性。在透明和白內(nèi)障的人晶狀體中，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)活性和表達沒有檢測到，盡管如此，模板RNA在各種人晶體中都存在。端粒在透明晶體中大概比在白內(nèi)障晶體中長1kb. 端粒的長度可能與白內(nèi)障的病因有關(guān)。hTERT cDNA引入由G418選擇的人晶狀體上皮細胞產(chǎn)生了穩(wěn)定的具有hTERT的人晶狀體上皮細胞系。迄今為止在這個細胞系中，hTERT能使經(jīng)過48次群體倍增后的細胞仍然正常生長并且增強了其對抗氧化應(yīng)激的抗調(diào)亡活性。

　　將hTERT引入晶狀體上皮細胞，這使得轉(zhuǎn)染細胞具有端粒酶活性。到目前為止，hTERT在晶狀體上皮細胞的表達使得正常生長的轉(zhuǎn)染細胞能群體倍增108代，并且這些細胞在倍增后形態(tài)和生長上仍然非常正常。通過合成新的端粒，hTERT阻止復(fù)制衰老，并且通過MEK/ERK，蛋白激酶C,蛋白激酶A的調(diào)節(jié)和最終MEK/ERK信號通道的表達，端粒酶抑制了晶狀體上皮細胞的分化。在體內(nèi)外重建的研究中顯示hTERT能形成功能復(fù)雜的人模板RNA。hTERT催化亞單位引入端粒酶陰性的正常人細胞能使其端粒伸長和延長細胞壽命。[5]

　　2.復(fù)制衰老與角膜

　　1.角膜內(nèi)皮與衰老

　　在體內(nèi)角膜，無論供者的年齡，人周邊區(qū)角膜內(nèi)皮細胞比中央?yún)^(qū)有更好的復(fù)制能力。年老供者人中央角膜內(nèi)皮細胞有復(fù)制能力，但復(fù)制能力比年輕供者中央?yún)^(qū)細胞要顯著降低。減少的復(fù)制能力與中央角膜細胞顯示的衰老樣特征增加相關(guān)。[6]

　　2角膜基質(zhì)與衰老

　　角膜基質(zhì)主要由200-250層平行排列的纖維小板組成，在這方面研究得較少，但體外研究的衰老皮膚和肺成纖維樣細胞中表明有過度表達的膠原酶，彈性蛋白酶，同時，它們的組織抑制金屬蛋白酶的表達大幅減少，蛋白多糖合成失敗，纖維結(jié)合蛋白以另一種細胞粘附效力低的底物形式產(chǎn)生，并且遷移率和成纖維細胞收縮膠原網(wǎng)格的能力也下降[7]。但在衰老的角膜基質(zhì)中其成纖維細胞表達是否也具有衰老特征尚需實驗證實。

　　3.角膜上皮與衰老

　　衰老與廣泛生理應(yīng)激抵抗力降低密切相關(guān)。眼表的改變致使老化角膜能更多的被各種原因感染。衰老晶狀體上皮的通透性改變表現(xiàn)為晶狀體上皮屏障功能下降或淚膜接觸時間增多[8]。上皮細胞整聯(lián)蛋白亞基分布的改變也能降低上皮屏障功能。a6和B4亞基組成半橋粒，隨著年齡增加它們變成不連續(xù)的。盡管如此，沿著基底膜的半橋粒的數(shù)量和分布不隨時間改變而改變。角膜細胞上調(diào)粘附分子和下調(diào)吞噬反應(yīng)多形核苷酸的能力的發(fā)生也與年齡相關(guān)。[9]

　　3.復(fù)制衰老與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞

　　由人端粒酶基因表達的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞在群體倍增100次后與其它的內(nèi)皮細胞都有著類似的形態(tài)學(xué)和生長反應(yīng)。它表達血管假性血友病因子,一種區(qū)別內(nèi)皮細胞與其它細胞類型的關(guān)鍵標記，在重建的基底膜基質(zhì)形成血管源性網(wǎng)，并且以VEGF依賴的方式形成小管樣三維膠原結(jié)構(gòu)。從端粒和端粒酶的研究中得出端粒酶縮短與細胞衰老的起始相關(guān)，因此，異位表達的人端粒酶基因能在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞表達，使其繞過第一個細胞周期檢查點，但不能繞過第二個細胞周期檢查點，因此，使產(chǎn)生的血管內(nèi)皮細胞壽命延長，但不能使壽命無限制。[10]

　　三．復(fù)制衰老與視網(wǎng)膜色素上皮細胞

　　1. 高級糖化最終產(chǎn)物（AGE）與RPE衰老

　　AGE的形成是引發(fā)老年疾病的開始。AGEs與許多人體重要疾病的病理生理有聯(lián)系，它做為調(diào)節(jié)者，不僅在糖尿病綜合癥中，在許多年齡相關(guān)的病理性疾病中都有重要作用。眼內(nèi)許多組織細胞都與糖尿病和衰老有關(guān)，AGEs被認為是可能的重要視力機能紊亂的調(diào)節(jié)者。[11]。AGE是一種異質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物，由蛋白的主要氨基團和糖類衍生物乙醛基團雜合反應(yīng)形成。研究表明AGE加速衰老改變的積聚并且引起了早期年齡相關(guān)性疾病，包括動脈粥樣硬化,白內(nèi)障，神經(jīng)變性疾病,腎衰竭，關(guān)節(jié)炎和AMD. 我們發(fā)現(xiàn)AGE積聚在老化的人BM和有免疫功能的基底沉積物中。[12]雖然AGE的熒光在給予D-半乳糖的RPE脈絡(luò)膜中增加，ERG則顯示沒有AGE誘導(dǎo)的器官毒性。RPE-脈絡(luò)膜層增加的衰老超微結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的早期炎癥、基質(zhì)膨脹和不正常類脂加工有關(guān)，隨后，增加的衰老超微結(jié)構(gòu)下調(diào)能量代謝基因，上調(diào)晶體蛋白基因，并且改變細胞結(jié)構(gòu)基因的表達。[13]

　　2．氧化應(yīng)激與RPE衰老

　　正常視力要求有功能的RPE-bruch's膜-脈絡(luò)膜組織來支持視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層。光氧化應(yīng)激，光感受器外節(jié)脫落，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，高代謝作用的要求和需氧量的增加，導(dǎo)致高水平的氧化應(yīng)激。結(jié)果，隨著年齡增加，RPE和脈絡(luò)膜毛細血管內(nèi)皮細胞形態(tài)消失。

　　染色體端粒單鏈核酸斷裂作為一種度量，用來表示在培養(yǎng)的RPE細胞中氧化DNA損傷。細胞終末限制片斷(TRF)平均長度在40%氧中比在20%氧中縮短得要快。S1核酸酶測定顯示積累的平均TRF長度的縮短是由于增加的單鏈核酸斷裂積聚在末端染色體DNA中。反應(yīng)氧中介物的產(chǎn)生和血紅素加氧酶-1mRNA的誘導(dǎo)在40%氧中比在20%氧中更深，體外培養(yǎng)RPE340細胞在慢性高氧中的生長顯示了DNA通過增多的單鏈核酸在端粒DNA中斷裂蓄積而受損傷。這些改變提供了衰老RPE細胞DNA氧化損傷的證據(jù)。[14]

　　氧化應(yīng)激引起細胞結(jié)構(gòu)許多改變，這些結(jié)構(gòu)的改變能改變細胞表現(xiàn)型。為研究氧化應(yīng)激對細胞功能改變的機制，使用化學(xué)氧化劑或高氧的體外模型已經(jīng)確定。每種氧化劑有不同的急性損傷，因此與體內(nèi)細胞的關(guān)聯(lián)性仍需研究。用輕度高氧來誘導(dǎo)體外RPE細胞低的、慢性的氧化應(yīng)激 來模擬體內(nèi)RPE細胞的環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40%氧產(chǎn)生可檢測到的氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)適度RPE表型改變，并且伴隨著基因表達的改變和染色體DNA的損傷，輕度高氧誘導(dǎo)RPE細胞過早衰老。在40%氧中生長的細胞在群體倍增早期水平就停止增殖，而在20%氧中則相對較晚。增加的SABG陽性細胞和減少的BRDU陽性細胞在40%氧中比在20%氧中更早發(fā)育。 [15]

　　3.BRUCH膜與RPE衰老

　　隨著年齡增加，RPE和脈絡(luò)膜毛細血管內(nèi)皮細胞形態(tài)消失。最顯著的改變是BM內(nèi)的沉積物.

　　BRUCH膜中沉積物的定位和合成與年齡相關(guān)性疾病有關(guān)。但基底部分子水平的結(jié)構(gòu)還沒有很好的解決。[16]

　　4．內(nèi)皮素-1與RPE復(fù)制衰老

　　內(nèi)皮素-1能產(chǎn)生類似視神經(jīng)病變?nèi)缜喙庋鄣纳窠?jīng)損傷作用。內(nèi)皮素在眼后極部精確的來源仍然不清楚。目前的研究是確定RPE是否是ET-1局部的來源，衰老RPE細胞的ET-1調(diào)節(jié)釋放與TNF-a調(diào)節(jié)不同，它的調(diào)節(jié)釋放依靠培養(yǎng)物的衰老程度。RPE可能是ET-1在視網(wǎng)膜的起源，從給予TNF-a后的觀察來看，它釋放的增加可能在血視網(wǎng)膜屏障破壞中起更重要作用。合成和分泌ET-1在成熟RPE中比在糼年RPE中要多，TNF-a在這兩種表現(xiàn)型中都引起了顯著前內(nèi)皮素原-1mRNA水平和ET-1分泌。在用TNF-a后，兩種表型中明顯出現(xiàn)細胞破裂和緊接著的緊密連接屏障的斷裂。[17]

　　5.端粒酶與RPE衰老

　　當(dāng)端粒變得非常短時，大部分被病毒癌基因轉(zhuǎn)錄的正常細胞最后都進入M2期。為了獲得無限的生長能力，這些細胞不得不利用端粒酶活性克服M2期。端粒酶表達需要病毒轉(zhuǎn)化的前M2期細胞來防止進入M2危機期。人RPE細胞與猿猴病毒40中T抗原共同轉(zhuǎn)化并且VR3克隆在M2前期已經(jīng)獲得。然后，VR3細胞與包含端粒酶的帶菌細胞一起轉(zhuǎn)染并且兩種細胞暫時或連續(xù)表達的端粒酶被克隆和分別命名為ST1和ST2。正常的RPE細胞在36次群體倍增后進入衰老，雖然在VR3克隆中壽命延長了20多倍，但它最終進入了M2危機期。與正常RPE細胞相比VR3端粒長度減少，并且在傳代培養(yǎng)中繼續(xù)減少。盡管如此，表達T抗原和端粒酶的ST1與ST2克隆能防止這種危象。ST1與ST2原始細胞的端粒長度比正常細胞長。當(dāng)端粒酶表達減退、伸長的端粒又變短時，ST1再次經(jīng)受生長抑制，但ST2維持端粒酶活性，端粒長度增殖得以繼續(xù)。結(jié)果，端粒酶活性明確需要克服M2危機期并且獲得人體上皮細胞無限的壽命，這個細胞無限增殖化機制是從M1危機逃避中獨立出來。[18]

　　6.Beta半乳糖苷酶與RPE細胞衰老

　　應(yīng)用B-半乳糖苷酶和端粒酶長度檢測 ，可以發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)RPE細胞可以隨著傳代次數(shù)的增加，出現(xiàn)衰老細胞表型的累積，這種累積與RPE細胞中溶酶體活性相關(guān)。應(yīng)用同樣的技術(shù)，在不同年齡獼猴眼的冰凍切片中也發(fā)現(xiàn)衰老細胞隨年齡累積的現(xiàn)象 。通常認為培養(yǎng)條件下的RPE細胞在經(jīng)過30代左右的傳代后，細胞增殖能力明顯下降，胞體增大，并出現(xiàn)長的突起。10代以內(nèi)發(fā)生復(fù)制衰老的RPE細胞<15％ ，而在經(jīng)過20代以上的傳代后，復(fù)制衰老的細胞數(shù)>70％ ，并出現(xiàn)明顯的體積增大，細胞體的不規(guī)則突起增多，細胞的增殖能力也明顯降低 。但細胞的復(fù)制衰老是一種累積性的變化，我們也觀察到個別Beta-半乳糖苷酶活性檢測陽性細胞仍然可以出現(xiàn)分裂像表型，但明顯出現(xiàn)胞體變大、失去多角形態(tài)、長的細胞突起明顯增多等改變。這些細胞可能在繼續(xù)培養(yǎng)的過程中完全進入G1期，并停滯在G1期，失去有絲分裂能力，但細胞仍然是存活的，具有一定的生物學(xué)活性。同時,在培養(yǎng)的第5代就可以檢測到復(fù)制衰老細胞的出現(xiàn)，這個現(xiàn)象與其他研究的發(fā)現(xiàn)也是吻合的，相關(guān)的解釋認為，由于后極部的RPE細胞所處的代謝環(huán)境明顯與周邊的細胞不同，因此取材于后極部的RPE細胞提前出現(xiàn)復(fù)制衰老的累積特征的可能性要大很多，這個推論也被在體內(nèi)的RPE細胞復(fù)制衰老檢測所證實[19]

　　最近的研究表明，人RPE細胞復(fù)制衰老不僅表現(xiàn)為beta半乳糖苷酶的染色，還表現(xiàn)為精確的染色體端粒的縮短。從細胞循環(huán)中退出的衰老RPE細胞能被溴脫氧尿苷標記，這個結(jié)果顯示培養(yǎng)的RPE細胞中積聚了beta半乳糖苷酶成陽性的細胞，并作為群體倍增的功能之一。為了研究體內(nèi)RPE細胞，衰老相關(guān)的beta半乳糖苷酶組織化學(xué)過程最近被修改了，同樣的組織化學(xué)過程加上了漂白后染色步驟，這可以使染色的RPE細胞清晰可見。全球第一個改良后研究是在恒河猴中進行，從1歲到29歲，結(jié)果顯示beta半乳糖苷酶陽性細胞的積聚。