1例難治性多發(fā)性骨髓瘤患者，在接受清髓性化療（馬法蘭，140mg/m2體表面積）和自體干細(xì)胞移植后，進(jìn)行自體抗CD19嵌合抗原受體T細(xì)胞（CTL019）治療。4年前，這例患者曾接受更高劑量的馬法蘭（200mg/m2）和自體干細(xì)胞移植，獲得了短暫的緩解。在自體移植后接受CTL019治療獲得完全緩解，治療后12個月的最近的一次評估中，沒有發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展的證據(jù)，在血清和尿液中沒有發(fā)現(xiàn)蛋白克隆。盡管患者惡性漿細(xì)胞99.95%不表達(dá)CD19，但仍然獲得了這一響應(yīng)。（諾華等資助，ClinicalTrials.gov編號：NCT02135406）

　　重組自體T細(xì)胞特異性表達(dá)CD19嵌合抗原受體在B細(xì)胞腫瘤的治療中擁有廣闊的前景。之前我們報道了，利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染自體T淋巴細(xì)胞構(gòu)建的CD3-ζ/CD137抗CD19嵌合抗原受體自體T細(xì)胞（CTL019）可使難治性慢性淋巴細(xì)胞性白血病和B-細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病獲得持續(xù)緩解。據(jù)報道，多發(fā)性骨髓瘤作為B細(xì)胞系腫瘤通常不表達(dá)CD19，因此CD19不作為多發(fā)性骨髓瘤免疫治療的靶標(biāo)。然而有一些報告指出，微量的具有耐藥性，疾病復(fù)發(fā)特性的多發(fā)性骨髓瘤克隆，具有B細(xì)胞表型（即CD19陽性）。此外，在我們尚未公布的觀察結(jié)果表明，惡性漿細(xì)胞表達(dá)低水平CD19比之前的報道更加常見，并且在體外，CTL019對CD19表達(dá)水平極低的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。基于這些觀察，我們推測CTL019細(xì)胞對多發(fā)骨髓瘤具有療效。由于多發(fā)性骨髓瘤中僅有小部分表達(dá)CD19，我們進(jìn)一步推測，CTL019僅對進(jìn)行了CD19陰性漿細(xì)胞清除治療的患者有效。因此我們進(jìn)行了一項對難治性多發(fā)性骨髓瘤患者的臨床試驗(yàn)，以檢測安全性和可行性，并初步評估輸注CTL019聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)療法（包括高劑量馬法蘭和自體干細(xì)胞移植）治療多發(fā)性骨髓瘤的療效。在此，我們報告第一例按照該方案治療的患者的結(jié)果。

　　病例報告

　　患者，女性，在2009年，43歲時出現(xiàn)脊椎壓縮性骨折后經(jīng)IgAkappa診斷為多發(fā)性骨髓瘤。接受來那度胺，硼替佐米，地塞米松治療后獲得初步緩解，但在暫停用藥為自體干細(xì)胞移植采集造血干細(xì)胞時病情進(jìn)展。隨后接受了順鉑，阿霉素，環(huán)磷酰胺和依托泊苷的96小時輸注療法。其后用非格司亭動員并采集造血干細(xì)胞。2010年5月14日，患者接受高劑量馬法蘭（200mg/m2體表面積）并進(jìn)行了自體造血干細(xì)胞移植。根據(jù)國際骨髓瘤工作組（IMWG）響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，初次自體移植獲得了部分響應(yīng)（圖1A）。大約在移植后1個月開始接受來那度胺的維持治療。約2個月后，患者的血清IgA濃度開始上升，以致需加用硼替佐米（圖1A）。在移植后的181天達(dá)到IMWG的移植后進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)。隨后的聯(lián)合治療方案包括來那度胺，硼替佐米，carfilzomib，泊馬度胺，伏立諾他，克拉霉素和elotuzumab。2014年6月在接受了9項一線療法后，患者加入了CTL019細(xì)胞聯(lián)合自體干細(xì)胞移植的臨床試驗(yàn)。在第二次移植前，給予2個周期的環(huán)磷酰胺（每周期給藥劑量1200mg/m2，給藥時間不低于96小時），以用來在篩選評估和CTL019制備期間控制骨髓瘤。在第二次移植時（圖1A），患者的血清IgA濃度為6310毫克/分升，血清單克隆蛋白濃度（Mspike）為6.2克/分升。骨髓活檢顯示多發(fā)性骨髓瘤超過了95%（圖2A），復(fù)雜的染色體分型，間期熒光的T原位雜交（FISH）法發(fā)現(xiàn)TP53缺失，以及1q21的擴(kuò)增，所有這些都提示多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后較差。

　　方法

　　研究設(shè)計

　　該試驗(yàn)通過了賓夕法尼亞大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并且按照協(xié)定，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志可使用該篇文章的全文。所有作者參與了數(shù)據(jù)的收集和分析，推動了原稿的書寫和編輯，并確保數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性。倒數(shù)第二位作者作出了稿件提交出版的決定。本項研究的經(jīng)費(fèi)贊助商諾華制藥核準(zhǔn)了稿件。申請資格包括之前接受過自體移植治療，依據(jù)IMWG標(biāo)準(zhǔn)在最初移植治療后不足1年疾病進(jìn)展，以及擁有良好的心肺功能和低溫保存的用于第二次移植的自體造血干細(xì)胞。如前所述，利用自體白細(xì)胞制備CTL019細(xì)胞，CTL019目標(biāo)劑量為1×107~5×107表達(dá)嵌合抗原受體的T細(xì)胞。研究治療包括中高劑量馬法蘭（140？200mg/m2），自體干細(xì)胞回輸（≥2.1×106個細(xì)胞/kg），以及隨后的第12~14天CTL019輸注。根據(jù)方案，可以選擇在移植后100天開始使用來那度胺進(jìn)行維持治療。

　　研究評估

　　分別在移植前，移植后42天和移植后100天，以及根據(jù)臨床需要在其他時間點(diǎn)進(jìn)行血清和尿蛋白電泳，免疫球蛋白定量檢測，血清游離輕鏈檢測和骨髓活檢。

　　使用流式細(xì)胞術(shù)和定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對骨髓和外周血進(jìn)行評估，來檢測CTL019的植入。用流式細(xì)胞術(shù)對移植前和移植后的骨髓樣本進(jìn)行檢測，以評估CTL019在多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞中的表達(dá)和患者移植后的微量殘留病灶。進(jìn)一步使用多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞熒光激發(fā)分選（FACS），再通過定量逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR（RT-PCR）測定CD19的表達(dá)。如前所述使用Luminex公司檢測方法對血清細(xì)胞因子濃度進(jìn)行測定。最后，作為微量殘留的分子檢測，用IGH（免疫球蛋白重鏈基因）的深度測序來確認(rèn)在基線的骨髓取樣中骨髓瘤特異性IGH序列，并確定100天后骨髓樣本中它是否還存在。

　　圖A表示在劑量為200mg/m2體表面積（MEL200）的馬法蘭處理下，初次ASCT后lgA濃度變化趨勢（左側(cè)），以及在劑量為140mg/m2體表面積（MEL200）的馬法蘭處理和CTL019輸注，在第二次ASCT后lgA濃度變化趨勢（右側(cè)）。在首次ASCT后6個月，附加的治療包括來那度胺（LEN），硼替佐米（BTZ），地塞米松（DEX）和克拉霉素（CLR）。第二次ASCT之前連續(xù)輸注環(huán)磷酰胺兩個周期（CY）。同時也顯示了在第二次ASCT前和ASCT后期間血清單克隆蛋白濃度(Mspike)。圖2表示在第二次ASCT后CTL019輸注，通過流式細(xì)胞術(shù)測定每立方毫米細(xì)胞數(shù)（僅外周血）和通過定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）法測定每微克基因組DNA慢病毒載體序列的拷貝數(shù)（外周血和骨髓），以及通過每立方毫米細(xì)胞數(shù)測定相應(yīng)的B細(xì)胞頻率。圖C表示血清鐵蛋白，IFN-γ和IL-6濃度。

　　結(jié)果

　　可行性和毒性反應(yīng)

　　患者接受140mg/m2劑量（從標(biāo)準(zhǔn)劑量的200mg/m2降低以最大限度減少毒性作用）的馬法蘭后進(jìn)行自體干細(xì)胞移植。移植相關(guān)性毒性反應(yīng)包括4級白細(xì)胞和血小板減少，3級黏膜炎，2級惡心和厭食，中性粒細(xì)胞減少發(fā)熱和金黃色葡萄球菌菌血癥。在接受CTL019輸注當(dāng)天（移植后第12天），中性粒細(xì)胞絕對數(shù)已升至200/立方毫米，患者無發(fā)熱且無菌血培養(yǎng)超過48小時。CTL019劑量為5×107個表達(dá)嵌合抗原受體的T細(xì)胞。與馬法蘭給藥前的淋巴細(xì)胞絕對數(shù)390/立方毫米相比，CTL019輸注當(dāng)天淋巴細(xì)胞絕對數(shù)840/立方毫米（T細(xì)胞占49%）。CTL019輸注后，沒有發(fā)燒或出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征的跡象，炎性反應(yīng)已在其他CTL019臨床試驗(yàn)中被觀察到。在移植前患者有低丙種球蛋白血癥，這常見于多發(fā)性骨髓瘤患者；在移植后100天這一現(xiàn)象仍然存在，這歸因于CTL019對正常B細(xì)胞和漿細(xì)胞的影響。沒有觀察到其他CTL019相關(guān)性不良反應(yīng)；早期沒有特別指出的不良反應(yīng)都為1或2級。移植后經(jīng)過100天，所有移植相關(guān)性毒性反應(yīng)已得到處置。在移植后130天使用來那度胺，劑量為5mg/天；由于胃腸毒性反應(yīng)隨后劑量調(diào)整為每周2次，每次5mg。

　　第二次ASCT前骨髓穿刺活檢（圖A）HE染色（左）和CD138免疫染色（右）顯示超過95%為多發(fā)骨髓瘤。在第二次ASCT后100天獲得的取樣（圖B）HE染色（左）和CD138免疫染色（右）顯示整體細(xì)胞密度為1-2%并且沒有漿細(xì)胞。

　　臨床應(yīng)答

　　單克隆IgA濃度（通過血清蛋白電泳法測定）和血清總IgA濃度在移植后開始下降，并在CTL019輸注后進(jìn)一步下降（圖1A）。lgA最低濃度低于下限量（7mg/分升）。在移植后100天骨髓活檢顯示整體細(xì)胞密度1~2%且無漿細(xì)胞（圖2B）。此時，"嚴(yán)格完全緩解"的所有條件，在IMWG分類中最好的響應(yīng)類別，都得到滿足；除了尿蛋白電泳檢測到微弱的kappa輕鏈，但在一個月后的復(fù)檢中也不存在。100天骨髓取樣的流式細(xì)胞檢測和IGH深度測序檢測微小殘留病灶為陰性。IGH深度測序是指每3.11×106個骨髓細(xì)胞中惡性漿細(xì)胞數(shù)小于1。

　　與患者的在基線取得的幾乎全部為惡性漿細(xì)胞（估計＞95%）的骨髓細(xì)胞腫瘤負(fù)荷相比，100天中腫瘤負(fù)荷減少相對量超過5-log10。移植后12個月，患者血液和尿中沒有出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白的證據(jù)，沒有出現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤癥狀或臨床征兆。與第一次移植和其他全部現(xiàn)有的治療相比，移植聯(lián)合CTL019細(xì)胞療法可更完全、更持久地降低多發(fā)骨髓瘤負(fù)荷。

　　CTL019的移植，全身炎癥標(biāo)志物和B細(xì)胞再生障礙

　　輸注后第2天到第47天（移植后第61天），通過流式細(xì)胞術(shù)（以0.3~1.7/立方毫米細(xì)胞數(shù)或0.1~0.2%外周血總T細(xì)胞數(shù)）和定量PCR在輸在外周血中檢測CTL019細(xì)胞。在輸注后30天（移植后42天）用流式細(xì)胞術(shù)（0.1%T細(xì)胞）和定量PCR在骨髓中檢測到CTL019細(xì)胞，但在輸注后88天（移植后100天）消失（圖1B）。CTL019輸注后血清干擾素-γ和鐵蛋白上升，在輸注前血清IL-6濃度升高，并隨著體內(nèi)CTL019水平的降低而下降（圖1C）。炎癥標(biāo)志物沒有上升到之前使用CTL019引發(fā)的細(xì)胞因子釋放綜合征那樣的程度。正如預(yù)期，B細(xì)胞重建與檢測到的CTL019丟失相關(guān)。通常在多發(fā)性骨髓瘤患者接受自體移植后自體T細(xì)胞輸注后14天檢測到B細(xì)胞，早期的B細(xì)胞再生障礙可能是CTL019和馬法蘭共同作用而不是大劑量馬法蘭單獨(dú)作用。

　　多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞CD19的表達(dá)

　　以患者接受自體移植前作為基線進(jìn)行骨髓穿刺，通過流式細(xì)胞術(shù)來分析多發(fā)骨髓瘤中CD19的表達(dá)?？梢源_定在漿細(xì)胞瘤中以CD38+CD45-免疫表型和kappa輕鏈限制性占主導(dǎo)地位（圖3）。多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞群體中CD19僅占0.05%（圖3A）。微量的CD19+亞群表達(dá)細(xì)胞內(nèi)kappa輕鏈（圖3B）和B細(xì)胞成熟抗原（BCMA），這是漿細(xì)胞特異性標(biāo)志物（未示出），證實(shí)了其作為惡性漿細(xì)胞群體的一部分。此外，在CD19+一個小亞群CD45+細(xì)胞中檢可識別到一小集群Kappa限制性漿細(xì)胞（圖4，陰影內(nèi)圖片）?；€骨髓樣本中其他的CD19+集群包含多克隆CD19+CD20+B細(xì)胞和小部分CD45+CD38（陰性）+CD20-CD19+輕鏈陰性細(xì)胞，很可能是pro-B細(xì)胞或幼稚pre-B細(xì)胞（圖4）。為了更靈敏地鑒定CD19的表達(dá)，我們使用FACS在CD19表達(dá)的2個閾值下對占主導(dǎo)的漿細(xì)胞集群進(jìn)行分選（圖3A），并且我們通過RT-PCR測定法分析了分選的漿細(xì)胞CD19信使RNA（mRNA）的存在。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測99.95%骨髓瘤漿細(xì)胞為CD19陰性的細(xì)胞沒有檢測到CD19mRNA（圖3C）。

　　討論

　　我們報告了1例晚期多發(fā)性骨髓瘤患者接受CTL019聯(lián)合自體移植治療后，獲得持續(xù)完全緩解。疾病負(fù)荷顯著降低和響應(yīng)的持久性與以往移植治療的響應(yīng)相比，盡管有大量的干預(yù)治療和低劑量的馬法蘭，但仍表明良好的應(yīng)答是因?yàn)镃TL019和馬法蘭的聯(lián)合使用，而不是單獨(dú)使用馬法蘭。正常CD19+B細(xì)胞重建和檢測到CTL019的丟失提示這種響應(yīng)不必CTL019持續(xù)保持活性。

　　在大多數(shù)情況下，多發(fā)性骨髓瘤主要為終末分化的CD19陰性漿細(xì)胞，雖然亞群很小，如在從例患者觀察到的少量CD19+漿細(xì)胞群，可以通過B細(xì)胞和漿細(xì)胞之間的光譜低分化表型來確定。低分化表型的骨髓瘤細(xì)胞可能引發(fā)了抗藥性，克隆性疾病庫通過骨髓微環(huán)境結(jié)構(gòu)維持并通過酶蛋白抑制劑治療富集。因此，針對這些亞群的治療可能會與常規(guī)療法產(chǎn)生協(xié)同作用，并且這一協(xié)同作用可用來解釋這一報道中的有利反應(yīng)。本文編譯作者愛康得Paul認(rèn)為這種情況下CTL019的臨床相關(guān)靶標(biāo)可能為非腫瘤CD19+細(xì)胞，這已牽涉到實(shí)體瘤治療的免疫逃逸和耐受。

　　圖A表示ASCT前取出的骨髓中多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞表面CD19表達(dá)（CD38+CD45？門，左）?？蚣埽ㄓ遥┍硎緹晒忾撝担鶕?jù)表面CD19的表達(dá)，用于多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞熒光激活細(xì)胞分選，以分析CD19信使RNA含量。圖B表示ASCT前骨髓取樣的惡性漿細(xì)胞總?cè)后w免疫球蛋白輕鏈的表達(dá)（左）和惡性漿細(xì)胞CD19+亞群。圖C表示健康供體外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）和ASCT前骨髓取樣惡性漿細(xì)胞FACS中CD19+亞型逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析結(jié)果。結(jié)果以健康供體外周血單個核細(xì)胞CD19+表達(dá)為基準(zhǔn)并以半對數(shù)坐標(biāo)標(biāo)注，ND表示未檢出。I字形狀表示95%置信區(qū)間。

　　這例從CTL019中受益的患者未發(fā)生細(xì)胞因子釋放綜合征。之前根據(jù)單例患者同情用藥協(xié)定，我們給一例多發(fā)性骨髓瘤患者在自體干細(xì)胞移植后2天使用劑量為5×108細(xì)胞的CTL019。這例患者獲得很好的部分緩解，并經(jīng)歷了CTL019相關(guān)的嚴(yán)重細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性；這些毒性與體內(nèi)CTL019的強(qiáng)力擴(kuò)增相關(guān)。根據(jù)這一毒性反應(yīng)的結(jié)果，以及之前觀察到的自體移植后過繼輸注的T細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增的治療-進(jìn)度-依賴效應(yīng)，我們目前的方案是，在接下來的臨床試驗(yàn)中使用更低劑量的CTL019，輸注定在自體移植后的12，13或14天，而不是在移植后2天。

　　從圖3可以看出，移植前骨髓穿刺取樣經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析表明，多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞群體特征除CD19+外CD38+CD45？占主要部分。分析前，通過設(shè)門排除雙峰，碎片，T細(xì)胞，單核細(xì)胞和死細(xì)胞（未示出）。CD45+細(xì)胞（上排，左圖）中發(fā)現(xiàn)含有以下CD19+細(xì)胞群：多克隆CD19+CD20+B細(xì)胞（最上面一排，中間和右側(cè)圖）；一小部分漿細(xì)胞群體（BCMA+CD38+），是CD19+一個亞群并都具有kapaa限制性（陰影內(nèi)圖片），這表明它們是多發(fā)性骨髓瘤克隆的一個組份；以及一小群CD45+CD38（陰性）+CD20-CD19+細(xì)胞無免疫球蛋白輕鏈的表達(dá)，最可能是pro-B細(xì)胞或幼稚pre-B細(xì)胞（第三行左側(cè)和中間圖）。BCMA表示B細(xì)胞成熟抗原。

　　10例患者，包括現(xiàn)在所述的這例患者，到目前為止都已經(jīng)接受了治療（詳見附錄中表S1，NEJM.org）。10例中6例仍保持疾病無進(jìn)展。僅有1例患者出現(xiàn)了CTL019相關(guān)性1級細(xì)胞因子釋放綜合征，1例因自體移植物抗宿主反應(yīng)引發(fā)的3級小腸結(jié)腸炎。

　　綜上所述，我們報告了1例晚期難治性多發(fā)骨髓瘤患者，在經(jīng)過高劑量馬法蘭和自體移植后輸注CTL019，獲得了持久的完全緩解，盡管在絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中沒有CD19的表達(dá)。